红藻氨酸诱导内质网应激模型的途径

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.36.021

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (36): 5861-5867.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.36.021

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红藻氨酸诱导内质网应激模型的途径

袁磊¹，张海霞¹，钱诗蕾¹，徐斌¹，龚济钦¹，刘湘华²，唐园¹，禹华旭^2，3

1长沙医学院第一临床学院，湖南省长沙市 410219
2长沙医学院第一附属医院，湖南省长沙市 410219
3长沙医学院湖南省重点建设学科，湖南省长沙市 410219

修回日期:2014-06-03 出版日期:2014-08-30 发布日期:2014-08-30
通讯作者: 禹华旭，博士，博士后，副教授，长沙医学院湖南省重点建设学科，长沙医学院第一附属医院，湖南省长沙市410219
作者简介:袁磊，男，1991年生，湖南省绥宁县人，汉族，长沙医学院2010级临床医学本科在读。并列第一作者：张海霞，女，1992年生，湖南省祁阳县人，汉族，长沙医学院2011级临床医学本科在读。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81171136)；湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目(湘教通[2013]19号-431，湘教通[2012]402号-445)；湖南省教育厅自然科学重点研究项目(10A013)；湖南省重点学科建设项目资助([2011]76号)

Kainic acid-induced endoplasmic reticulum stress model

Yuan Lei¹, Zhang Hai-xia¹, Qian Shi-lei¹, Xu Bin¹, Gong Ji-qin¹, Liu Xiang-hua², Tang Yuan¹, Yu Hua-xu^{2, 3}

1First Clinical College of Changsha Medical University, Changsha 410219, Hunan Province, China
2First Affiliated Hospital of Changsha Medical University, Changsha 410219, Hunan Province, China
3Changsha Medical University, Key Disciplines in Hunan Province, Changsha 410219, Hunan Province, China

Revised:2014-06-03 Online:2014-08-30 Published:2014-08-30
Contact: Yu Hua-xu, M.D., Associate professor, First Affiliated Hospital of Changsha Medical University, Changsha 410219, Hunan Province, China; Changsha Medical University, Key Disciplines in Hunan Province, Changsha 410219, Hunan Province, China
About author:Yuan Lei, First Clinical College of Changsha Medical University, Changsha 410219, Hunan Province, China Zhang Hai-xia, First Clinical College of Changsha Medical University, Changsha 410219, Hunan Province, China Yuan Lei and Zhang Hai-xia contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81171136; University Students Research and Innovative Pilot Project of Hunan Province Education Department, No. [2013]191-431 and No. [2012]402-445; the Natural Science Research Projects of Education Department of Hunan Province, No. 10A013; Key Subject Construction Project of Hunan Province, No. [2011]76

摘要/Abstract

摘要：

背景：前期研究表明，海马内注射红藻氨酸海可诱发兴奋性红藻氨酸受体KA1亚受体在海马神经元的表达明显上调，内质网应激标志物磷酸化真核翻译起始因子2α表达增加并伴随细胞死亡。
目的：探讨红藻氨酸海马内注射后内质网应激发生的机制。
方法：取昆明小鼠32只，将0.15 nmol 红藻氨酸注入海马CA1区域，注射时间为60 s。分别于红藻氨酸注射后第1，2，3，4，5，6，8，12小时灌注取脑，灌注取脑前进行Bederson体征评分，然后行全脑切片FJB染色分析与免疫荧光双标记观察。
结果与结论：①红藻氨酸注射后第3，4，5，6，8小时，Bederson体征评分表明中枢神经功能出现明显损伤，FJB染色示小鼠海马内神经元死亡明显；注射后第1，2，12小时，Bederson体征评分中枢神经功能未见明显损伤，FJB染色小鼠海马神经元死亡结果不明显。②根据FJB结果，取第3，8小时的脑片做免疫组化。海马内注射红藻氨酸后导致海马神经元中KA1和磷酸化真核翻译起始因子2α在相同的时间点表达明显上调，将KA1与磷酸化真核翻译起始因子2α图片结果进行叠加处理，两者完全重合，表明KA1的表达和内质网应激发生在同一个神经细胞内。结果表明红藻氨酸首先诱导了兴奋性膜上受体KA1表达的上调，其KA1的表达上调可能引起细胞内质网功能紊乱，导致内质网应激反应，并进一步促进了神经细胞的死亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织构建, 红藻氨酸, 修复重建, 移植, 内质网应激, 糖尿病脑病, 免疫荧光双标记, KA1亚受体, 海马, Adobe Photoshop CS5, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have shown that kainic acid injected into hippocampus can significantly upregulate the expression of excitatory KA1 subunit of the kainate receptor in the hippocampus, and endoplasmic reticulum stress markers, phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2, accompanied by cell death.
OBJECTIVE: To explore the mechanism of endoplasmic reticulum stress after kainic acid is injected into the hippocampus.
METHODS: 0.15 nmol kainic acid was injected into the hippocampal CA1 region of 32 adult male Kunming mice, the injection time was 60 seconds. At different time points (1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 and 12 hours) after kainic acid was injected, the Bederson score analysis was performed, and then the brain was harvested after cerebral perfusion. FJB staining of brain sections and immunofluorescence double labeled observation were also performed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) At 3, 4, 5, 6, 8 hours after kainic acid injection, Bederson score showed severe injury of central nervous system function, and FJB staining showed the increased of cell death in the hippocampus (P < 0.05); At 1, 2, 12 hours after injection, Bederson score showed no obvious injury of central nervous system function, and FJB staining showed unobvious cell death in the hippocampus (P > 0.05). (2) According to the results of FJB staining, the brain sections were selected at 3, 8 hours for immunohistochemistry. The expressionlevels of KA1 receptors and endoplasmic reticulum stress marker P-eIF2α were up-regulated at the same time after kainic acid was injected into hippocampus. Two single-staining KA1 and P-eIF2α immunofluorescence images were synthesized into one over-lapped double-stained image, and two images overlapped, indicating that the up-regulated expression of KA1 and endoplasmic reticulum stress occurred in the same nerve cells. Kainic acid first up-regulated the excitatory receptor KA1 expression, which may cause cell endoplasmic reticulum dysfunction and result in the endoplasmic reticulum stress response, further promoting neuronal cell death.

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Key words: kainic acid, endoplasmic reticulum, hippocampus

中图分类号:

R318

袁磊，张海霞，钱诗蕾，徐斌，龚济钦，刘湘华，唐园，禹华旭. 红藻氨酸诱导内质网应激模型的途径[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(36): 5861-5867.

Yuan Lei, Zhang Hai-xia, Qian Shi-lei, Xu Bin, Gong Ji-qin, Liu Xiang-hua, Tang Yuan, Yu Hua-xu. Kainic acid-induced endoplasmic reticulum stress model[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(36): 5861-5867.

图/表（结果） 1

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引言

糖尿病脑病是糖尿病慢性并发症之一，是指因糖尿病引起的中枢神经系统的神经生理及结构改变，最终导致神经元的损害，临床表现为认知功能障碍、痴呆、精神性疾患等慢性脑病症状^[1]。早在20世纪20年代，Miles和Root首先报道糖尿病患者存在认知功能障碍。1965年Nielsen通过观察16例糖尿病患者脑组织尸检标本，提出了“糖尿病脑病”的概念。但因其发病隐匿、进展缓慢，发病机制尚未明确，仍缺乏明确的诊断标准，尽管有学者提出“糖尿病脑病”作为一种独立的病种还不能被广泛接受，其概念更倾向于脑部结构功能受损的严重状态，称为“糖尿病性认知功能障碍”似更为合理^[2-3]。高血糖可累及中枢神经系统这一点是肯定的，如何早期诊断、治疗及预防糖尿病脑病是目前糖尿病并发症领域的研究热点之一。体内发生内质网应激时，引起胰岛素信号转导障碍，造成脑内胰岛素抵抗，引发糖尿病脑病。2004年Science杂志发表的2篇文章显示，内质网应激是导致糖尿病、胰岛素抵抗和肥胖发生的重要环节，内质网应激因此成为治疗糖尿病与糖尿病脑病的一个新的具有强大潜力的新靶点^[4-7]。

细胞凋亡的信号转导途径有死亡受体介导的信号途径(外源性途径)、线粒体途径(内源性途径)、颗粒酶B途径及近年来越来越引起关注的内质网应激介导的凋一亡途径^[8]。内质网是真核细胞中蛋白质合成、折叠与分泌的重要膜性细胞器，具有多种生理功能，包括蛋白质翻译后修饰、折叠和装配，类固醇合成，脂质合成，糖原合成与分解，还在细胞内钙的贮存和维持细胞内Ca²⁺稳态中起重要作用^[9]。灵敏感知细胞内外环境的改变并引发细胞适应性反应，是实现内质网功能的基本条件。尽管通常状况下内质网具有极强的自稳功能，但仍有多种因素(如细胞内钙稳态失衡、蛋白质加工障碍等)可干扰内质网功能，导致未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网内堆积，触发内质网应激^[10-11]。这种构象性应激反应，可被随后诱导产生的未折叠蛋白反应调节减弱，所以常用参与未折叠蛋白反应的标志性分子来提示内质网应激的发生。未折叠蛋白反应主要包括^[11-12]：通过激活内质网跨膜蛋白蛋白激酶R样内质网激酶介导的真核翻译起始因子2α磷酸化，抑制蛋白质合成，防止未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网腔内的进一步蓄积；通过激活eIF2α(p)、活化转录因子6及Ⅰ型跨膜蛋白激酶/核糖核酸内切酶上调内质网内常驻蛋白(如折叠酶、分子伴侣等)，提高内质网对未折叠蛋白或错误折叠蛋白的处理能力，以缓冲并修复应激所致的细胞损伤。然而，内质网应激是把“双刃剑”，在应激早期，内质网合成蛋白的能力短暂减弱，这有助于减少蛋白进入内质网腔内而防止内质网过度负荷；随后，编码内质网蛋白翻译、折叠、输出、降解的基因被激活，促进内质网对蓄积在其内错误折叠或未折叠蛋白质的处理，而有利于维持细胞正常功能；最后，若内质网应激及未折叠蛋白反应过强或持续存在时，内质网应激信号将由促生存转向促凋亡，启动细胞凋亡机制，以清除损伤过度细胞。因此，内质网应激既是细胞抵抗应激的生理反应，又是造成细胞损伤的重要机制^[13]。总之，内质网应激在维持机体生理平衡、内环境稳态中起到重要作用^[14]。越来越多的证据表明，内质网作为凋亡通路的调节器，在糖尿病脑病获得性认知和行为功能缺损中起重要作用^[15-17]。海马神经元具有高度发达的内质网，对内质网内稳态紊乱极为易感，是脑内对神经病理事件如脑缺血和脑损伤等脆弱的区域之一^[18-20]，因此海马可作为体内诱导内质网应激的理想场所。

近年来大量科学研究已证实，兴奋性神经递质谷氨酸(盐)受体有3种：NMDA受体、AMPA受体和红藻氨酸(kainic acid，KA)受体^[21-22]。有关NMDA受体和AMPA受体活化致细胞兴奋性中毒死亡通路较为明确，KA受体由5种亚受体组成：GluR5、GluR6、GluR7、KA1、KA2^[23]，但其功能到目前为止仍未明了。最新研究发现，KA1受体表达的变化主要出现在海马CA1和CA3区，且证实KA促使KA1受体亚单位在海马神经元CA区重新分布，增加了神经元对兴奋性氨基酸毒性的敏感性，导致神经元死亡及中枢神经功能缺失^[24-25]。

课题组的研究结果表明，海马内注射KA后诱发了兴奋性KA1亚受体在海马神经元的表达明显上调，内质网应激标志物磷酸化真核翻译起始因子2α(Phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2，P-eIF2α)表达明显增加，且KA1的表达和内质网应激发生在同一个神经细胞内，FJB染色示海马内细胞死亡增加。因此，抑制KA1在海马神经元的表达有望成为阻碍糖尿病脑病内质网应激发生的新方向。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2013年5月至2014年1月在长沙医学院湖南省重点建设学科人体解剖与组织胚胎学科研实验室完成。

材料：

实验动物：8-10周雄性昆明小鼠32只，体质量(23±2) g，动物室内温度(18±3) ℃，湿度(50±20)%，每日光照12 h，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2011-0003。所有的动物实验均遵守1995年神经科学协会颁布的《动物使用政策》。

实验方法：

动物分组：将32只昆明小鼠随机分为8组，海马内注射KA后第1，2，3，4，5，6，8，12小时，每个时间段4只。

动物癫痫模型制作^[8]：小鼠腹腔内注射2.5%三溴乙醇(0.02 mL/g)麻醉，然后将其固定在脑立体定位仪上，使用微量注射器将0.15 nmol KA(300 nL×0.5 mmol/L)注射进海马CA1区域(药物注射定位坐标依照立体定位图谱进行定位^[26]，确定前后囟在同一水平线上后，以前囟为零点，前囟以后1.8 mm，旁开1.7 mm，深度1.6 mm)，注射时间为60 s。注射完后将针头后撤0.1 mm，停留2 min便于所注射液体在CA区域扩散吸收。麻醉清醒并于灌注取脑前对小鼠进行Bederson体征评分，以确定海马内注射KA后对小鼠中枢神经功能的影响。Bederson体征评分标准分为4个功能等级^[27]：0分，无神经缺失症状，无任何异常行为；1分，瘫痪侧前肢屈曲(悬尾试验不能完全伸展对侧前爪)；2分，提尾时，前肢抵抗对侧推力能力下降(伴有前肢屈曲)，未出现向瘫痪侧的自发性旋转运动；3分，提尾时，瘫痪侧前肢屈曲，瘫痪侧阻力降低，抵抗力减小且自发向对侧转圈。随后经心脏灌注生理盐水再灌注体积分数4%甲醛，取全脑，置于4 ℃冰箱固定过夜18-24 h，次日置于30%蔗糖PBS溶液48 h，至脑沉底。将全脑在-30 ℃冷冻切片机切片，厚度20 μm，切片保存在0.02%叠氮化钠的PBS里。

FJB染色流程^[28-29]：将固定的脑切片移至载玻片， 55℃干燥2 h，使用0.000 4%FJB染色20 min，通过荧光显微镜进行观察。

免疫组织化学方法^[30]：选择一抗goat anti-KA1 receptor和rabbit anti-phospho-eIF2α混合双抗，混合后的工作浓度分布为1∶200和1∶400，切片置于4 ℃含一抗的体积分数为3%小牛血清和0.1%Triton-100的PBS中反应过夜，次日经PBS-T(1×PBS/0.1%Triton-100)浸洗后，切片在rabbit anti-goat IgG，TRITC和goat anti-rabbit IgG，FITC混合的荧光双标二抗里(工作浓度都为1∶200)常温黑暗环境孵育 1 h，然后水洗烘干后在荧光显微镜下观察检测。

图像处理方法^[^31]：共聚焦显微镜的操作系统为奥林巴斯BX51/BX52系统。根据所用荧光素(FITC和TRITC)，于同一视野中分别拍下绿色荧光图A(代表P-eIF2α的表达)和红色荧光图片图B(代表KA1的表达)。应用Adobe Photoshop CS5软件(Adobe公司) 将KA1与P-eIF2-α图片分别进行叠加处理得到双标图像C。

主要观察指标：小鼠Bederson体征评分及海马神经元细胞的形态学观察。

统计学分析：应用SPSS 16.0软件进行统计学处理。通过Student t-test检验每个时间段组的差异性，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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讨论

糖尿病脑病的发病机制复杂，很多研究已证实，糖尿病可造成以获得性认知和行为缺陷为特征的认知功能障碍^[32]。而出现明显认知功能障碍的糖尿病大鼠，海马CA1区神经元凋亡显著增加，提示神经元凋亡参与了糖尿病海马损伤所致认知功能障碍的发病过程^[33]。但目前尚不能以单一学说解释其真正发病原因，近年来对糖尿病脑病的研究主要集中在代谢因素、氧化应激、微血管内皮细胞功能损伤、免疫紊乱和细胞凋亡等问题上，而作为细胞凋亡3大经典途径之一的内质网凋亡途径也是目前研究的热点^[16]。Lewen等^[34]研究结果也提示，氧化应激产生的活性氧离子ROS能够氧化内质网腔内蛋白，破坏内质网膜上Ca²⁺通路，破坏内质网稳态，诱发内质网应激，说明内质网通路在糖尿病脑病发病机制中很可能有一定的作用。内质网应激是内质网通路的核心内容^[35]，此外内质网分泌相关蛋白ERP29表达下调^[36]，说明糖尿病早期脑组织与内质网功能即受到影响，内质网应激很可能参与了糖尿病早期对中枢神经系统的损伤。内质网通路是区别于其他两条途径新近提出的可独立诱导细胞凋亡的又一途径^[37]。适度的内质网应激可提高内质网处理未折叠或错误折叠蛋白的能力，促进细胞存活；但应激时间过长或程度过强，细胞内稳态不能恢复，将最终诱导细胞凋亡。因此，内质网应激既是细胞抵抗应激的生理反应，又是应激造成细胞损伤的重要机制。研究证实，内质网应激是应激后细胞内发生的最早反应，是线粒体氧化应激等细胞应激反应的共同初始通路；内质网应激可独立于其他途径直接诱导细胞凋亡^[35]。近年来，内质网应激在神经系统疾病发生发展中的作用受到广泛关注。而关于内质网应激可引起神经元凋亡，已在许多退行性疾病如帕金森病、阿尔茨海默病等的发病机制研究中得到证实^[38]。在这些神经退行性疾病中，蛋白沉积、局部炎症反应、低氧、Ca²⁺平衡失调等均可影响内质网内稳态，导致错误折叠或未折叠蛋白蓄积，从而引发内质网应激。

海马是中枢前脑结构中边缘系统的重要组成部分，参与体内多种生理功能的调节。海马结构在空间定位、学习记忆、内脏调节、情绪反应、行为反射的调控中具有重要作用，与其他脑区有着广泛的纤维联系，其中多数脑区都与痛或镇痛有关^[39]。海马也是糖尿病脑病的主要病变部位^[40]。研究证明，海马对许多慢性损伤如外伤、缺血、缺氧、衰老、高血糖、高血脂和高血压等较敏感，在这些致病因素的作用下海马神经元数量减少，形态异常或功能失调，引起神经退行性病变的发生^[41]。最新有文献报道，1型糖尿病脑病小鼠海马组织内发生了内质网应激，内质网应激可能在糖尿病脑病神经元变性中发挥重要作用^[17]。KA1亚受体在由海马内注射KA所致神经元兴奋性中毒死亡中起着重要作用^[25]，进一步的研究证实，KA1亚受体在小鼠海马内表达的重分布状况对海马神经元死亡亦起着十分重要的作用^[24]。

KA又称海人酸或海人藻酸，是从日本红海藻中提取的一种物质，它对神经细胞有较高的选择性损伤作用，其结构类似谷氨酸，是一种具有强烈致痫作用的兴奋性神经毒素，是离子型兴奋性谷氨酸受体的激动剂。KA在脑组织内直接与神经元突触后膜的KA受体结合，可以产生兴奋性突触后电流，引起动物颞叶癫痫，即KA癫痫模型^[42-43]。而海马、纹状体、下丘脑等处存在特异性高亲和力的KA受体，尤其是海马CA3区的KA受体密度最高，也最容易出现神经细胞过度兴奋和兴奋性氨基酸毒性作用^[44-45]。KA诱发的边缘性惊厥和海马结构损伤与人类颞叶癫痫的惊厥行为及Ammon角硬化有很多相似之处，是目前研究颞叶癫痫的较好动物模型^[46]。缺血再灌注及痫性发作后，脑内兴奋性氨基酸将大量释放，对神经细胞产生兴奋性毒性作用；KA的毒性作用可能通过以下两种途径产生：一是由于氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体和KA受体过度兴奋所导致，以Na⁺内流为特征，可在数小时内发生，使神经细胞出现急性渗透性肿胀；二是神经细胞延迟性损伤，由N-甲基-D-天(门)冬氨酸(NMDA)受体过度兴奋所导致，以Ca²⁺内流为特征，可在数小时至数日后发生^[47]。本实验在KA海马内注射几小时内灌注取脑，其诱导细胞凋亡作用主要通过第一种途径，即AMPA受体和KA受体过度兴奋，而KA1亚受体的过度兴奋有着重要作用。

作者以往在对laminin水解片段上调KA1表达促神经元兴奋性中毒的机制研究中显示^[25]：KA海马内注射1 h和2 h后c-fos基因的表达主要在DG区域，但KA注射2 h后免疫组化显示KA1亚受体在CA1区的表达大量增加，KA注射4 h后c-fos基因的表达扩展到CA1-3区，KA注射6 h后c-fos基因的表达较4 h下调。c-fos基因是即刻早期反应基因的重要成员，大量研究表明，许多即刻早期反应基因在缺氧缺血再灌注早期被激活，参与调节细胞、组织对损伤刺激的信号传导及应答。c-fos过度表达与神经元凋亡有必然联系且参与细胞凋亡过程，但其具体机制尚未完全明了。有研究认为c-fos基因的启动是诱发缺氧缺血后神经细胞凋亡的可能机制之一^[48-49]。闫慧^[50]用6 g/L的KA脑室注射，结果显示在KA注射3 h，procaspase-3已开始激活，6 h后激活达到顶峰，12 h组与6 h组无显著差别。王林晓^[51]经侧脑室注射6 g/L的KA，作用1 h、3 h、6 h、12 h、1 d等6个时间点，发现GluR6发生疏基亚硝基化，且亚硝基化水平随KA刺激作用的时间不同发生变化，在6 h时达到最高，之后开始有所降低。赵延芳^[52]研究表明在海马CA1、CA3/DG区KA注射6 h后，FasL与Fas、FADD、procaspase8的结合增强，procaspase8水解作用增强，活化的caspase8的表达升高。张佳^[53]的研究表明不同时间段KA作用的大鼠海马CA1、CA3/DG区Bcl-2蛋白水平下降具有时间依赖性，在KA作用6h后，Bcl-2蛋白水平下降得更为明显。无论是procaspase-3的激活、GluR6发生疏基亚硝基化、FasL与Fas的结合增强还是Bcl-2蛋白降解都可导致细胞凋亡，国内徐州医学院近几年的研究时间都不约而同的定格在6 h，说明6 h是KA注射后海马神经元损伤或凋亡的较明显的时期。本实验第1，2小时未见神经元明显死亡，第3-5小时海马CA1-3区神经元死亡逐渐增多，5 h中CA1-3区神经元死亡最明显，6-8 h逐渐减少，而第12小时仅见少量死亡；第3小时中KA1和P-eIF2α的表达较第8小时的略明显，与前期在国外的研究结果相一致^[25]，与国内徐州医学院的相关研究基本符合，其存在少量的差异可能与KA的不同给药途径、不同KA浓度、不同品种老鼠的个体差异及实验偶然误差等因素有关。

实验结果证明了海马内注射KA后诱发了的兴奋性受体KA1在海马神经元CA1区的表达明显上调，内质网应激标志物P-eIF2α表达明显增加并伴随细胞死亡。根据Kerr等提出的细胞凋亡3条通路，作者推测海马内注射KA后首先诱导膜上受体KA1的表达上调，然后将凋亡信号进一步向细胞内传递，进而导致未折叠和错误折叠蛋白在内质网内堆积使得内质网功能紊乱，诱导内质网应激，引起细胞的未折叠蛋白反应，促使细胞启动凋亡程序中的内质网通路，导致细胞凋亡。应用Adobe Photoshop CS5软件将KA1与P-eIF2-α图片分别进行叠加处理结果图片完全重叠，说明KA1的表达和内质网应激发生在同一个神经细胞内，进一步佐证了作者的推测。

糖尿病脑病是因糖尿病引起的神经元结构和功能损害，主要发病机制为内质网应激，目前缺乏明确的诊断和防治标准^[54]。根据本课题的研究结果和细胞器结构与功能的变化及神经递质与受体在糖尿病中枢神经系统病变过程中所起作用的研究现状，提示兴奋性KA受体KA1亚型在糖尿病脑病内质网应激介导神经元退行性变过程中起着重要作用，这将是糖尿病脑病发病机制的一重要突破口。

红藻氨酸诱导内质网应激模型的途径

Kainic acid-induced endoplasmic reticulum stress model

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